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    牛免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒說明書-上海滬崢

    發布時間: 2016-06-28   

    牛免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒說明書    

     

    目的:本試劑盒用于測定牛血清,血漿及相關液體樣本中免疫球蛋白G(IgG)的含量。

    實驗原理:

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中牛免疫球蛋白G(IgG)水平。用純化的牛IgG抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入免疫球蛋白G(IgG),再與HRP標記的IgG抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的免疫球蛋白G(IgG)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中牛免疫球蛋白G(IgG)濃度。

    牛免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒組成
    試劑盒 48孔配置 96孔配置 保存 
    說明書 1 1   
    封板膜 2片(48 2片(96   
    密封袋 1 1   
    酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存 
    標準品:36 μg/ml 0.5ml×1 0.5ml×1 2-8℃保存 
    標準品稀釋液 1.5ml×1 1.5ml×1 2-8℃保存 
    酶標試劑 3 ml×1 6 ml×1 2-8℃保存 
    樣品稀釋液 3 ml×1 6 ml×1 2-8℃保存 
    顯色劑A 3 ml×1 6 ml×1 2-8℃保存 
    顯色劑B 3 ml×1 6 ml×1 2-8℃保存 
    終止液 3ml×1 6ml×1 2-8℃保存 
    濃縮洗滌液 20ml×20倍)×1 20ml×30倍)×1 2-8℃保存

     
    牛免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒樣本處理及要求:
    1. 
    血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。

    2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

    3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

    4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBSPH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

    5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBSPH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

    6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.

    7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

    牛免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒操作步驟:
    1.
    標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在第一、第二孔中分別加標準品100μl,然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為24μg/ ml,16μg/ ml ,8μg/ ml,4μg/ ml, 2μg/ ml)。

    2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

    3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

    4.配液:將3048T20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水3048T20倍)倍稀釋后備用。

    5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

    6.加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

    7.溫育:操作同3。

    8.洗滌:操作同5。

    9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.

    10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

    11.測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

    注意事項:
    1.
    試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。

    2.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。

    3.各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。

    4.請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(×n×5)。

    5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

    6.底物請避光保存。

    7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

    8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

    9.本試劑不同批號組分不得混用。

    10.如與英文說明書有異,以英文說明書為準。

    結果計算:
    以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,   
    在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD     
    值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋      
    倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標      
    準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD      
    代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋      
    倍數,即為樣品的實際濃度。

    試劑盒性能:

    1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
    2.
    批內與批見應分別小于9%11%
     
    檢測范圍:                                              
    1.5μg/ ml -30μg/ ml
                                           
                               
    保存條件及有效期:
    1.
    試劑盒保存:;2-8℃。
    2
    .有效期:6個月

     

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